1-darsDifferensial ekspressiya tahlili: DESeq2, edgeR, limma-voom — model dizayni, kontrastlar va ko'p sinov tuzatishlariUshbu bo'lim DESeq2, edgeR va limma-voom yordamida differensial ekspressiya ish oqimlarini batafsil ko'rib chiqadi, model dizayni, kontrastlar, dispersiya baholash va ko'p sinov tuzatishlariga e'tibor qaratib, ishonchli gen ro'yxatlari va effekt o'lcham baholarini olish uchun.
Tajriba modellarini va kovariatsiyalarni loyihalashMurakkab taqqoslashlar uchun kontrastlarni o'rnatishDESeq2 ni to'liq ish oqimi bo'yicha ishga tushirishedgeR va limma-voom quvurlaridan foydalanishKo'p sinov tuzatishlari va FDR nazoratiLog2 katlama o'zgarishlarini va qisqartirishni talqinlash2-darsMa'lumotlar tashkiloti va fayl nomlash konventsiyalari: namuna varaqlari, xom/qayta ishlangan ajratish, izchil identifikatorlarUshbu bo'lim RNA-seq loyiha fayllarini tartibga solishning eng yaxshi amaliyotlarini tasvirlaydi, jumladan namuna varaqlari, katalog tartiblari, xom va qayta ishlangan ma'lumotlarni ajratish va skriptlash, kuzatish va takrorlanishni soddalashtiradigan izchil identifikatorlar.
Aniq katalog ierarxiyasini loyihalashXom va qayta ishlangan ma'lumotlarni ajratishMustahkam namuna varaqlari va metama'lumotlar yaratishIzchil namuna va kutubxona identifikatorlariMa'lumotnoma genomlari va indekslarni versiyalashLoyiha ma'lumotlarini zaxiralash va arxivlash3-darsGen darajasidagi miqdorlash strategiyalari: featureCounts, htseq-count, transkriptdan gen saraish uchun tximportUshbu bo'lim moslashtirilgan yoki psevdo-moslashtirilgan o'qishlardan gen darajasidagi miqdorlashni tushuntiradi, featureCounts va htseq-count ni solishtiradi va tximport transkript darajasidagi baholarni mustahkam gen darajasidagi matritsalar saraishini batafsil ko'rsatadi.
featureCounts variantlari bilan o'qishlarni hisoblashhtseq-count rejimlari va annotatsiyalardan foydalanishStrandlik va ko'p xaritalash o'qishlarini boshqarishSalmon va kallisto ni tximport bilan import qilishGen darajasidagi hisob matritsalarini qurishMiqdorlash sifati va qamrovini baholash4-darsMa'lumot yuklab olish va tashkiloti vositalari: SRA Toolkit (prefetch/fastq-dump), ENA FTP/Aspera, wget/rsync va tavsiya etilgan kirish/chiqishlarUshbu bo'lim RNA-seq ma'lumotlarini yuklab olish va tartibga solishning ishonchli strategiyalarini qamrab oladi, SRA Toolkit, ENA kirish, buyruq satri uzatish vositalari va avtomatlashtirish va takrorlanishni qo'llab-quvvatlaydigan izchil kirish va chiqish tuzilmalarini aniqlashga e'tibor qaratib.
SRA Toolkit prefetch va fasterq-dump dan foydalanishENA ga FTP va Aspera orqali kirishwget va rsync bilan xavfsiz yuklab olishXom va qayta ishlangan fayl formatlarini tanlashYuklab olish metama'lumotlari va checksumlarni hujjatlashtirishSkriptlar va loglar bilan yuklab olishni avtomatlashtirish5-darsSifat nazorati vositalari va chiqishlari: FastQC, MultiQC, tekshirish kerak bo'lgan asosiy ko'rsatkichlar (bazaviy sifat, adapter mazmuni, dublikat, GC)Ushbu bo'lim RNA-seq sifat nazoratiga qaratilgan bo'lib, FastQC va MultiQC yordamida bazaviy sifat, adapter ifloslanishi, dublikat va GC mazmuni kabi asosiy ko'rsatkichlarni umumlashtiradi va kesish yoki qayta sekvenslash zarurligini hal qiladi.
Xom va kesilgan o'qishlarda FastQC ni ishga tushirishBazaviy sifat profillarini talqinlashAdapterlarni va ortiqcha ketma-ketliklarni aniqlashDublikat va GC mazmunini baholashMultiQC bilan hisobotlarni umumlashtirishQC chegaralarini va harakatlarni aniqlash6-darsO'qishlarni kesish va filtrlash: qachon kesish, vositalar (Trim Galore/Cutadapt/fastp), asosiy parametrlari va chiqishlariUshbu bo'lim RNA-seq o'qishlarini qachon va qanday kesishni tushuntiradi, adapter va sifat kesishini, uzunlik filtrlashini va Trim Galore, Cutadapt va fastp da asosiy parametrlarni qamrab oladi, pastga oqim tahlillariga zarar yetkazadigan ortiqcha kesishdan qochib.
Kesish zarurligini hal qilishAdapter aniqlash va olib tashlash strategiyalariSifatga asoslangan kesish chegaralariMinimal uzunlik va murakkablik filtrlariTrim Galore va Cutadapt variantlaridan foydalanishIntegratsiyalashgan QC va kesish uchun fastp7-darsAsosiy pastga oqim tahlillari: GO/KEGG boyitish (clusterProfiler), GSEA oldindan tartiblangan, yo'l vizualizatsiyasi va gen to'plamini tanlashUshbu bo'lim differensial ekspressiyadan keyingi pastga oqim funksional tahlillarni tanishtiradi, clusterProfiler bilan GO va KEGG boyitish, oldindan tartiblangan GSEA, yo'l vizualizatsiyasi va gen to'plamlarini tanlash va filtrlash uchun asosli strategiyalarni qamrab oladi.
GSEA uchun tartiblangan gen ro'yxatlarini tayyorlashclusterProfiler bilan GO va KEGG boyitishTegishli gen to'plami bazalarini tanlashBoyitilgan yo'llar va tarmoqlarni vizualizatsiya qilishGen to'plamlarini filtrlash va ustuvor qilishFunksional natijalarni takrorlanadigan tarzda hisobot berish8-darsYuqori darajadagi quvur tartibi: ma'lumot yuklab olish, QC, kesish, moslashtirish/psevdo-moslashtirish, miqdorlash, differensial ekspressiya, pastga oqim tahliliUshbu bo'lim ma'lumotlarni olish va QC dan tortib, kesish, moslashtirish yoki psevdo-moslashtirish, miqdorlash, normalizatsiya, differensial ekspressiya va pastga oqim funksional tahlilgacha bo'lgan umumiy RNA-seq quvuri tuzilmasini taqdim etadi, modulli, skriptlangan ish oqimlariga urg'u berib.
Quvur bosqichlari va bog'liqliklarni aniqlashKirish, chiqish va fayl oqimini rejalashtirishQC, kesish va moslashtirishni integratsiya qilishMiqdorlashni DE tahliliga bog'lashDE ni boyitish ish oqimlariga ulashQuvurni diagrammalar bilan hujjatlashtirish9-darsNormalizatsiya va izlanish ma'lumotlarini tahlil qilish: TPM/FPKM chegaralari, DESeq2 normalizatsiyasi, PCA, namuna-namuna masofa issiq xaritalariUshbu bo'lim RNA-seq ma'lumotlarini normalizatsiya qilish va izlanish tahlilini qamrab oladi, TPM va FPKM ning cheklovlarini muhokama qiladi, DESeq2 ga asoslangan normalizatsiya, dispersiya stabilizatsiyasi, asosiy komponent tahlili va partiya effektlarini aniqlash uchun namuna masofa issiq xaritalarini.
TPM va FPKM o'lchovlarining cheklovlariDESeq2 o'lcham omillari va normalizatsiyasiDispersiyani stabilizatsiya qiluvchi va rlog transformatsiyalariNamunalarning asosiy komponent tahliliNamuna-namuna masofa issiq xaritalariPartiya effektlari va chetga chiqishlarni aniqlash10-darsAsosiy vizualizatsiya eng yaxshi amaliyotlari: MA grafiklar, vulkan grafiklar, issiq xaritalar, yo'l nuqta grafiklar va interaktiv hisobot variantlari (R Markdown, Jupyter)Ushbu bo'lim RNA-seq natijalari uchun samarali vizualizatsiya strategiyalarini tanishtiradi, differensial ekspressiya, namuna tuzilishi va yo'l o'zgarishlarini aniq yetkazishga urg'u berib, statik grafiklar va R Markdown yoki Jupyter da qurilgan interaktiv, takrorlanadigan hisobotlardan foydalanib.
MA grafiklarini qurish va talqinlashDE genlar uchun aniq vulkan grafiklarini loyihalashNashr sifatidagi issiq xaritalarni qurishBoyitish natijalari uchun yo'l nuqta grafiklarInteraktiv R Markdown RNA-seq hisobotlariJupyter ga asoslangan izlanish vizualizatsiyasi11-darsMoslashtirish vs psevdo-moslashtirish: STAR, HISAT2, Salmon, kallisto — savdo-offslar va chiqishlar (BAM, transkript/gen hisoblari)Ushbu bo'lim STAR va HISAT2 kabi moslashtirishga asoslangan vositalarni Salmon va kallisto kabi psevdo-moslashtirish vositalari bilan solishtiradi, tezlik, aniqlik, resurs ishlatish va BAM fayllari va transkript yoki gen darajasidagi hisoblarni o'z ichiga olgan chiqishlardagi savdo-offslarni ajratib ko'rsatadi.
STAR yoki HISAT2 moslashtirgichlarini qachon tanlashGenom indekslari va annotatsiyalarni sozlashSalmon ni kvazi-xaritalash rejimida ishlatishTez miqdorlash uchun kallisto ni ishga tushirishBAM va quant.sf uslubidagi chiqishlarni solishtirishTezlik, xotira va aniqlikni benchmark qilish