Leson 1Configuration du système et plomberie : dégazage, autoéchantillonneur, commutation de colonne et impact du volume de temps mortPasse en revue les composants clés du système et la plomberie qui affectent les performances de la méthode, y compris le dégazage, la conception de l'autoéchantillonneur, les dimensions des tubes et la commutation de colonne. Met l'accent sur le volume de temps mort et le contrôle de la dispersion hors colonne.
Méthodes de dégazage et prévention des bullesConception de l'autoéchantillonneur et contrôle du reportID des tubes, longueur et effets de dispersionRobinet de commutation de colonne et configurationsMesure et ajustement du volume de temps mortLeson 2Sélection de la phase stationnaire : chimies C18, taille des pores, taille des particules, obturation des extrémités, hybride vs siliceDétaille comment choisir les phases stationnaires en phase inversée, en se concentrant sur les variantes C18, la taille des pores et des particules, l'obturation des extrémités, et hybride vs silice pure. Met l'accent sur l'adéquation de la chimie de la phase aux propriétés des analytes et aux objectifs de la méthode.
Densité de liaison C18 et type de ligandPhases obturées vs non obturéesTaille des pores pour petites molécules vs peptidesPhases silice hybride vs silice traditionnelleChoix de la taille des particules selon les besoins de performanceLeson 3Contraintes pratiques pour les laboratoires pharmaceutiques : débit d'échantillons, robustesse et compatibilité des solvantsTraite des contraintes réelles dans les laboratoires pharmaceutiques, incluant le débit d'échantillons, la robustesse, la compatibilité des solvants et la gestion du cycle de vie. Relie les attentes réglementaires aux choix pratiques de méthodes et d'instruments.
Équilibre entre temps d'analyse et résolutionÉtudes de robustesse et de solidité des méthodesCompatibilité des solvants avec les analytes et jointsMinimisation de l'utilisation de solvants et élimination des déchetsAttentes réglementaires pour les méthodes de routineLeson 4Principes de la HPLC en phase inversée et mécanismes de rétentionPrésente les principes fondamentaux de la HPLC en phase inversée, incluant les interactions hydrophobes, la partition et le rôle de la composition de la phase mobile. Relie les mécanismes de rétention aux choix pratiques dans le développement de méthodes.
Interactions hydrophobes et partitionRôle du modificateur organique dans la rétentionEffet de la polarité de l'analyte et logPInfluence de la température sur la rétentionAnalytes ionisables en HPLC phase inverséeLeson 5Sélection du détecteur et optimisation de la longueur d'onde pour la détection UV : balayage de spectres, utilisation du réseau de diodes, compromis de sensibilitéCouvre la sélection du détecteur UV et l'optimisation de la longueur d'onde, incluant les détecteurs à longueur d'onde fixe, variable et réseau de diodes. Explique le balayage de spectres, les contrôles de pureté des pics et l'équilibre entre sensibilité, sélectivité et bruit.
Détecteurs à longueur d'onde fixe vs variable vs réseau de diodesSélection de λmax à partir des spectres UVBande passante, bruit et compromis de sensibilitéÉvaluation de la pureté des pics avec spectres DADPlage linéaire et limites de saturation du détecteurLeson 6Choix entre gradient et isocratique : quand utiliser chacun, pente du gradient, considérations sur le volume de temps mortCompare l'élution isocratique et gradient, expliquant quand chacune est appropriée. Couvre la conception du profil de gradient, la pente et le temps d'analyse, les effets du volume de temps mort, et les stratégies pratiques pour un transfert robuste de gradients entre systèmes HPLC.
Quand choisir isocratique vs élution gradientConception de la force initiale et finale de la phase mobilePente du gradient, temps d'analyse et résolutionVolume de temps mort du système et retard de gradientTransfert de gradients entre instrumentsLeson 7Sélection du pH : relations pKa, effet sur la rétention et la forme des pics pour acides/bases faiblesExplique comment le pH de la phase mobile par rapport au pKa de l'analyte contrôle l'ionisation, la rétention et la symétrie des pics pour les acides et bases faibles, avec des conseils pour choisir le pH afin d'améliorer la résolution, la robustesse et la durée de vie de la colonne.
Ionisation des acides et bases faibles vs pHUtilisation de Henderson-Hasselbalch pour la sélection du pHImpact du pH sur la rétention et la sélectivitéInfluence du pH sur le gauchissement et l'aplatissement des picsLimites de pH des tampons pour la stabilité des colonnes en siliceLeson 8Formulation de la phase mobile : tampons (phosphate, acétate, ammonium), force ionique et préparation des tamponsSe concentre sur la sélection et la préparation des tampons de phase mobile, couvrant les tampons phosphate, acétate et ammonium volatils. Discute de la force ionique, du contrôle du pH, de la solubilité, de la filtration et de la compatibilité avec les détecteurs et colonnes.
Choix des espèces tampons et plage de pHCapacité tampon et effets de la force ioniquePréparation, filtration et dégazage des tamponsSolubilité des tampons avec forte teneur organiqueTampons volatils pour compatibilité MSLeson 9Modificateurs organiques : effets méthanol vs acétonitrile, force du solvant et sélectivitéExplique comment le méthanol et l'acétonitrile diffèrent en force de solvant, viscosité et sélectivité en HPLC phase inversée. Discute des systèmes organiques mixtes, des interactions avec la température, et des considérations pratiques telles que le coût et la sécurité.
Force des solvants dans les échelles élutotropiques RP courantesViscosité, contre-pression et effets de températureDifférences de sélectivité MeOH vs ACNUtilisation de modificateurs organiques mixtes pour réglageConsidérations de sécurité, coût et approvisionnementLeson 10Débit, température et volume d'injection : effets sur l'efficacité, la contre-pression et la forme des picsDécrit comment le débit, la température de la colonne et le volume d'injection influencent l'efficacité, la contre-pression, la rétention et la forme des pics. Fournit des règles pour l'adaptation du débit, l'évitement de la surcharge et l'optimisation de la température pour la robustesse.
Van Deemter et sélection optimale du débitEffets de la température sur la rétention et la cinétiqueVolume d'injection et surcharge de colonneInadéquation de solvant et distorsion des picsAdaptation du débit avec ID et longueur de colonneLeson 11Compromis sur les dimensions de colonne et la taille des particules : longueur, ID, 3–5 µm vs sub-2 µmDécrit comment la longueur de la colonne, le diamètre interne et la taille des particules affectent l'efficacité, la contre-pression, la sensibilité et le temps d'analyse. Fournit des conseils pour choisir les colonnes 3–5 µm vs sub-2 µm et adapter les dimensions entre systèmes.
Effet de la longueur de colonne sur résolution et tempsConsidérations sur le diamètre interne et la sensibilitéEfficacité et pression 3–5 µm vs sub-2 µmAdaptation des méthodes entre dimensions de colonnesImpacts des colonnes de garde et conception des frits
