Lección 1Configuración del sistema y plomería: desgasificación, autoinyector, cambio de columna e impacto del volumen de permanenciaRevisa componentes clave del sistema y plomería que afectan el rendimiento del método, incluyendo desgasificación, diseño del autoinyector, dimensiones de los tubos y cambio de columna. Enfatiza el volumen de permanencia y control de la dispersión extra-columna.
Métodos de desgasificación y prevención de burbujasDiseño del autoinyector y control de acarreoID de tubos, longitud y efectos de dispersiónVálvulas de cambio de columna y configuracionesMedición y ajuste del volumen de permanenciaLección 2Selección de fase estacionaria: químicas C18, tamaño de poro, tamaño de partícula, endcapping, híbrida vs síliceDetalla cómo elegir fases estacionarias de fase inversa, enfocándose en variantes C18, tamaño de poro y partícula, endcapping, e híbrida vs sílice pura. Enfatiza emparejar la química de la fase con las propiedades del analito y objetivos del método.
Densidad de unión C18 y tipo de ligandoFases endcapped vs no endcappedTamaño de poro para moléculas pequeñas vs péptidosFases de sílice híbrida vs sílice tradicionalElección de tamaño de partícula para necesidades de rendimientoLección 3Restricciones prácticas para laboratorios farmacéuticos: rendimiento de muestras, robustez y compatibilidad de solventesAborda restricciones del mundo real en laboratorios farmacéuticos, incluyendo rendimiento de muestras, robustez, compatibilidad de solventes y gestión del ciclo de vida. Vincula expectativas regulatorias con elecciones prácticas de métodos e instrumentos.
Equilibrio entre tiempo de corrida y resoluciónEstudios de robustez y ruggedness del métodoCompatibilidad de solventes con analitos y sellosMinimización del uso de solventes y disposición de residuosExpectativas regulatorias para métodos rutinariosLección 4Principios de HPLC de fase inversa y mecanismos de retenciónIntroduce principios centrales de HPLC de fase inversa, incluyendo interacciones hidrofóbicas, partición y rol de la composición de la fase móvil. Conecta mecanismos de retención con elecciones prácticas en desarrollo de métodos.
Interacciones hidrofóbicas y particiónRol del modificador orgánico en la retenciónEfecto de la polaridad del analito y logPInfluencia de la temperatura en la retenciónAnalitos ionizables en HPLC de fase inversaLección 5Selección de detector y optimización de longitud de onda para detección UV: escaneo de espectros, uso de arreglo de diodos, compensaciones de sensibilidadCubre selección de detector UV y optimización de longitud de onda, incluyendo detectores de longitud fija, variable y arreglo de diodos. Explica escaneo de espectros, chequeos de pureza de pico y equilibrio entre sensibilidad, selectividad y ruido.
Detectores fijos vs variables vs arreglo de diodosSelección de λmax de espectros UVCompensaciones de bandpass, ruido y sensibilidadEvaluación de pureza de pico con espectros DADRango lineal y límites de saturación del detectorLección 6Elecciones gradiente vs isocrático: cuándo usar cada uno, pendiente del gradiente, consideraciones de volumen de permanenciaCompara elución isocrática y gradiente, explicando cuándo cada una es apropiada. Cubre diseño de perfil de gradiente, pendiente y tiempo de corrida, efectos de volumen de permanencia y estrategias prácticas para transferencia robusta de gradientes entre sistemas HPLC.
Cuándo elegir elución isocrática vs gradienteDiseño de fuerza inicial y final de fase móvilPendiente del gradiente, tiempo de corrida y resoluciónVolumen de permanencia del sistema y retraso del gradienteTransferencia de gradientes entre instrumentosLección 7Selección de pH: relaciones pKa, efecto en retención y forma de pico para ácidos/bases débilesExplica cómo el pH de la fase móvil relativo al pKa del analito controla la ionización, retención y simetría del pico para ácidos y bases débiles, con guía para elegir pH que mejore resolución, robustez y vida útil de la columna.
Ionización de ácidos y bases débiles vs pHUso de Henderson-Hasselbalch para selección de pHImpacto del pH en retención y selectividadInfluencia del pH en cola y frente de picoLímites de pH de buffer para estabilidad de columna de síliceLección 8Formulación de fase móvil: buffers (fosfato, acetato, amonio), fuerza iónica y preparación de buffersSe enfoca en selección y preparación de buffers de fase móvil, cubriendo fosfato, acetato y buffers volátiles de amonio. Discute fuerza iónica, control de pH, solubilidad, filtración y compatibilidad con detectores y columnas.
Elección de especies de buffer y rango de pHEfectos de capacidad de buffer y fuerza iónicaPreparación, filtración y desgasificación de buffersSolubilidad de buffer con alto contenido orgánicoBuffers volátiles para compatibilidad con MSLección 9Modificadores orgánicos: efectos de metanol vs acetonitrilo, fuerza de solvente y selectividadExplica cómo metanol y acetonitrilo difieren en fuerza de solvente, viscosidad y selectividad en HPLC de fase inversa. Discute sistemas orgánicos mixtos, interacciones de temperatura y consideraciones prácticas como costo y seguridad.
Fuerza de solvente en escalas eluotrópicas RP comunesEfectos de viscosidad, contrapresión y temperaturaDiferencias de selectividad MeOH vs ACNUso de modificadores orgánicos mixtos para ajusteConsideraciones de seguridad, costo y suministroLección 10Caudal, temperatura y volumen de inyección: efectos en eficiencia, contrapresión y forma de picoDescribe cómo el caudal, temperatura de columna y volumen de inyección influyen en eficiencia, contrapresión, retención y forma de pico. Proporciona reglas para escalar caudal, evitar sobrecarga y optimizar temperatura para robustez.
Van Deemter y selección de caudal óptimoEfectos de temperatura en retención y cinéticaVolumen de inyección y sobrecarga de columnaDesajuste de solvente y distorsión de picoEscalado de caudal con ID y longitud de columnaLección 11Dimensiones de columna y compensaciones de tamaño de partícula: longitud, ID, 3-5 µm vs sub-2 µmDescribe cómo la longitud de columna, diámetro interno y tamaño de partícula afectan eficiencia, contrapresión, sensibilidad y tiempo de análisis. Proporciona guía para elegir columnas 3-5 µm vs sub-2 µm y escalar dimensiones entre sistemas.
Efecto de longitud de columna en resolución y tiempoConsideraciones de diámetro interno y sensibilidadEficiencia y presión 3-5 µm vs sub-2 µmEscalado de métodos entre dimensiones de columnaImpactos de columnas guarda y diseño de frit
